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            服務項目

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            CRISPR/Cas9基因敲除/敲入技術

            來源: 本站原創    作者:佚名   發布時間:2015/4/7 10:46:03

             

            服務描述

            制作原理

                   CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最新出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。 CRISPR 是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。在這一系統中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成雙鏈RNA,此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統能夠對小鼠和大鼠基因組特定基因位點進行精確編輯, 目前已經成功應用于大小鼠基因的KO/KI模型制備。

             

            服務流程和周期

             

             

             

            CRISPR/Cas9流程圖

                  Cas9結合gRNA,gRNA 的長度約為80個核苷酸,包含兩個區域:gRNA 5' 端前20個核苷酸對應于靶標DNA,能 結合在靶DNA 上的約60個核苷酸(gRNA 長度取決于表達gRNA 的質粒)形成一個發夾結構,這個結構能幫助 gRNA 與Cas9結合,并由此指導與DNA 的結合。
            通過gRNA上的靶點序列,在目標基因組上找到靶點序列,并揭開雙螺旋,Cas9將剪切DNA雙鏈,造成DNA雙鏈斷裂。Cas9使用簡單,可滿足多個靶點同時操作。

             

             

            CRISPR/Cas9技術特點

            1、可實現對靶基因多個位點或多個基因同時敲除;

            2、實驗周期短,價格低;

            3、可應用于大、小鼠等,無物種限制。

             

            服務類型

            1、全身性基因敲除

            2、點突變

            3、小片段基因敲入

            4、雙/多基因敲除

             

            建系原則與流程

            1、CRISPR/Cas9技術獲得的基因敲除鼠,由于是在大鼠或者小鼠的鼠原核受精卵期進行的修飾,獲得的F0鼠一般也是雜合子,并且每只FO鼠由于移碼突變情況可能不一樣,所以每只F0鼠也需要作為一個獨立的譜系進行傳代;

            2、原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代雜合子鼠,F0代雜合子鼠與野生型鼠進行交配,獲得測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠(可能有多種突變類型的F1);

            3、選擇來自同一只F0代鼠,突變類型一致的F1代鼠,達到性成熟后與進行同胞交配,可獲得F2代鼠。對交配獲得的F2代鼠進行PCR及測序鑒定,理論上, F2代鼠中25%為相同突變型的純合子鼠,有50%為只有一條染色體突變的雜合子鼠,有25%為野生型鼠。

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