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            LncRNAs測序

            來源: 本站原創    作者:佚名   發布時間:2015/3/31 11:13:45

             長鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNAs,LncRNAs)是一類長度大于200 nt且不編碼蛋白質的RNAs(不含rRNA),廣泛存在于各種生物體內。LncRNAs參與表觀遺傳、轉錄以及轉錄后等多水平的調控過程,在生命活動中具有重要作用。派森諾生物推出的LncRNA測序服務,使用高通量測序技術結合先進的生物信息學分析,一次性獲得樣本中幾乎全部的LncRNAs信息,為您全面、深入地研究LncRNAs的功能提供了全新的工具。

            一、技術路線

             Illumina MiSeq、Illumina HiSeq 2500和Nextseq 500

            二、生物信息分析

            標準信息分析
               1. 基本數據統計
               1.1 去除接頭序列、低質量序列得到clean data
               1.2 與核糖體數據庫比對,去除核糖體RNA數據

              2. LncRNA鑒定
               2.1 轉錄本組裝
               2.2 鑒定已知轉錄本(包括已知LncRNA)和新轉錄本
               2.3 預測新的LncRNA


              3. LncRNA定量及差異表達分析
               3.1 LncRNA定量及差異分析(需至少2個樣品)
               3.2 組間差異分析(需至少2組,每組至少3個樣品)
               3.3 LncRNA差異表達模式聚類


              4. LncRNA功能預測
               4.1 基于互補序列的LncRNA-mRNA互作分析
               4.2 基因上下游的LncRNA分析
               4.3 miRNA前體預測


              5. LncRNA家族預測分類

             

            高級信息分析

             

            1. CNC(coding-non-coding)共表達注釋(需5對以上case+control)
            2. Pathway富集分析

            三、樣品要求

            1. 總RNA:濃度≥200 ng/μl,總量≥10 μg;OD260/280介于1.8-2.2之間,OD260/230值應≥2.0。電泳檢測28S:18S至少大于1.5;并確保RNA無降解,無污染。

            2. 組織樣品:動物、植物、微生物總量大于500 mg的新鮮樣品(植物材料應盡量選取幼嫩部位)。采樣后將樣品立即用RNAlater和液氮速凍,保存于-80℃(保存期不超過一個月),送樣時使用干冰運輸(不超過72 h);提取RNA后經變性電泳,保證各RNA條帶清晰、比例適中、完整性好、無降解。特別要求樣品分成3份,方便后續提取,避免同一份樣品反復凍融造成樣品降解。

            3. 細胞樣品:先使用TRIzol試劑進行處理,每0.25 mL樣品(5-10×106個細胞)加入0.75 mL TRIzol試劑(可參考TRIzol試劑說明書),于-80℃保存,并提供2-3份該樣品。原則上不接收未經TRIzol處理的細胞樣品。

            4. 樣品保存期間切忌反復凍融。

            5. 送樣管務必標清樣品編號,管口使用Parafilm膜密封。

            四、迪巧的優勢

            1.  擁有標準化操作實驗室和Illumina Nextseq 500、Illumina MiSeq和Illumina HiSeq 2500高通量測序技術平臺,實驗周期短,質量可靠,可一次性獲得樣本中幾乎全部的LncRNA信息。


            2. 技術人員經驗豐富,技術穩定,建庫重復性好。


            3. 擁有專業的生物信息團隊和完整的生物信息分析服務體系,除人和鼠外,還可應用于其他真核物種,不局限于對已知LncRNA的研究,還可進行novel LncRNA的預測。


            4.  擁有標準的、實時更新的項目進展流程,有助于合作伙伴及時了解項目進展最新情況。


            5. 免費提供文章寫作指導服務和文章潤色服務。

            單細胞RNA-Seq通過對單個細胞的mRNA進行逆轉錄和PCR擴增,使用高通量測序手段,對單細胞中mRNA進行基因表達定量、功能富集、代謝通路等分析。它可以解決傳統RNA定量技術在早期胚胎發育、干細胞、癌癥、免疫等研究領域中存在的樣品量極低或細胞異質性的問題,是在單細胞水平研究基因表達強有力的工具,極大地拓展了RNA-Seq的應用范圍。

            一、技術路線

            二、生物信息分析

            標準信息分析

                 1. 原始數據去除接頭序列及低質量reads;
                2. 測序評估(數據比對統計,reads分布隨機性統計等)
                3. 差異表達基因分析
                4. 差異基因GO富集分析
                5. 差異基因KEGG富集分析

             

            高級分析

                 1. 主成分分析(5個以上樣品)
                2. 可變剪切分析
                3. SNP分析

            三、樣品要求

            1. 對于細胞樣品,同一部位/組織或同一類型細胞需確保平行有3-5個細胞;


            2. 除單細胞、微量細胞外,同時適用于起始模板為單染色體或已純化的低于100 ng總RNA;


            2. 越新鮮的細胞其擴增效率及覆蓋率越高,將樣品保存于0.2ml EP管中,用干冰運輸。凍存寄送時間盡量不要超過3天;


            4. 若為人細胞,要求送相應的血液、組織或細胞群等確認是否存在污染;


            5. 送樣細胞應經過以下步驟處理,確保無金屬離子影響實驗: 
               a. 加500ul PBS到100ul細胞懸液中,4000g離心5min;
               b. 去上清,加500ul PBS溶液重懸細胞;
               c. 1400g離心5min;
               d. 重復步驟b, c;
               e. 去上清,加100ul PBS重懸細胞。

            四、應用領域

            • 極微量樣品的表達分析(單個細胞)


            • 胚胎早期發育研究


            • 腫瘤細胞異質性研究


            • 免疫細胞群研究


            • 干細胞分化研究

            五、迪巧的優勢

            1. 極低起始量:單個細胞(10 pg total RNA)


            2. 高靈敏度:檢測到90%以上的基因表達


            3. 技術重復性好:基因表達一致性超過90%

          2. 上一個項目: 基因表達譜測序
          3. 下一個項目: 簡化基因組測序
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